Как можно изменить гены человека

Каждый из живых организмов на Земле носит в клетках наследственный материал своих предков. Эти данные называются геномами, и они нужны непосредственно для создания и поддержания деятельности организма. Генная инженерия работает над изменениями в наследственной информации. Рассказываем, что происходит с редактированием геномов прямо сейчас.

Применение генной инженерии в научных исследованиях

• Нокаут гена

Для изучения функции того или иного гена может быть применён нокаут гена. Так называется техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать последствия подобной мутации.

Для нокаута синтезируют такой же ген или его фрагмент, измененный так, чтобы продукт гена потерял свою функцию. Основные методы реализации: цинковый палец, морфолино и TALEN.

Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцисту суррогатной матери. У плодовой мушки дрозофилы мутации инициируют в большой популяции, в которой затем ищут потомство с нужной мутацией. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

• Искусственная экспрессия

Логичным дополнением нокаута является искусственная экспрессия, то есть добавление в организм гена, которого у него ранее не было. Этот способ генной инженерии также можно использовать для исследования функции генов. В сущности процесс введения дополнительных генов таков же, как и при нокауте, но существующие гены не замещаются и не повреждаются.

• Визуализация продуктов генов

Используется, когда задачей является изучение локализации продукта гена. Одним из способов мечения является замещение нормального гена на слитый с репортерным элементом, например, с геном зеленого флуоресцентного белка GFP. Этот белок, флуоресцирующий в голубом свете, используется для визуализации продукта генной модификации.

Хотя такая техника удобна и полезна, её побочными следствиями может быть частичная или полная потеря функции исследуемого белка. Более изощрённым, хотя и не столь удобным методом является добавление к изучаемому белку не столь больших олигопептидов, которые могут быть обнаружены с помощью специфических антител.

• Исследование механизма экспрессии

В таких экспериментах задачей является изучение условий экспрессии гена. Особенности экспрессии зависят прежде всего от небольшого участка ДНК, расположенного перед кодирующей областью, который называется промотор и служит для связывания факторов транскрипции.

Этот участок вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP или фермента, катализирующего легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать его функции.

Зачем нужна генная инженерия человека

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора.

Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента.

Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах.

Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — обыкновенная игрунка (Callithrix jacchus).

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем. В 2016 в США группа учёных получила одобрение на клинические испытания метода лечения рака с помощью собственных иммунных клеток пациента, подвергаемых генной модификации с применением технологии CRISPR/Cas9.

В конце 2018 года в Китае родились двое детей, геном которых был искусственно изменён (выключен ген CCR5) на стадии эмбриона методом CRISPR/Cas9, в рамках исследований, проводимых с 2016 года по борьбе с ВИЧ. Один из родителей (отец) был ВИЧ-инфицированным, а дети, по заявлению, родились здоровыми.

Поскольку эксперимент был несанкционированным (до этого все подобные эксперименты на человеческом эмбрионе разрешались только на ранних стадиях развития с последующим уничтожением экспериментального материала, то есть без имплантации эмбриона в матку и рождением детей), ответственный за него учёный не предоставил доказательств своим заявлениям, которые были сделаны на международной конференции по редактированию генома.

В конце января 2019 года властями Китая были официально подтверждены факты проведения данного эксперимента. Тем временем учёному было запрещено заниматься научной деятельностью и он был арестован.

Как редактируют человеческий геном?

• Метод «цинковые пальцы»

«Цинковые пальцы» встречаются и в составе человеческих белков. Благодаря этому методу можно сконструировать цепь ZFN так, что она будет узнавать определённый участок ДНК. Это дает возможность точечного воздействия на заданные участки в составе сложных геномов.

Домены «цинковые пальцы» встречаются в составе человеческих факторов транскрипции – белков, регулирующих процесс синтеза РНК с матрицей ДНК. При создании искусственных нуклеаз можно сконструировать цепочку из «цинковых пальцев» так, что она будет узнавать определенный участок ДНК.

Если такая цепочка будет достаточно длинной, она может распознавать относительно протяженные последовательности ДНК, состоящие из ряда тринуклеотидных фрагментов. Это означает реальную возможность точечного воздействия на заданные участки в составе больших сложных геномов.

Однако у метода «цинковых пальцев» обнаружились и серьезные недостатки: во-первых, это не вполне строгое распознавание тринуклеотидных повторов, что приводит к заметному числу расщеплений ДНК в «нецелевых» участках.

Во-вторых, метод оказался весьма трудозатратным и дорогостоящим, поскольку для каждой последовательности ДНК необходимо создать свою оптимизированную белковую структуру zinc-finger нуклеазы. Поэтому система «цинковые пальцы» широкого распространения не получила.

• TALEN

В 2011 году журнал Nature Methods назвал систему TALEN (Transcription Activator-like Effector Nucleases) «методом года» благодаря широкому спектру возможных применений в разных областях фундаментальной и прикладной науки.

TALEN — один из способов направленного внесения разрыва в ДНК с последующим его «залечиванием» — для выключения генов у мышей. Сразу после них эту технологию применили для внесения в мышиный геном мутации, приводящей к развитию одного из наследственных синдромов. Авторам метода моделирования генетически обусловленных болезней удалось не только «испортить» мышиный геном, но и исправить его обратно.

• CRISPR/Cas9

Метод обеспечивает точное воздействие на заданные участки ДНК и может быть использован практически в любой современной молекулярно-биологической лаборатории.

В основе этой системы — особые участки бактериальной ДНК — CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, или короткие палиндромные кластерные повторы). Разделяют эти повторы спейсеры — короткие фрагменты чужеродной ДНК. Последние встраиваются в геном после того, как ДНК рекомбинирует с её геномом.

Примеры редактирования человека

• Редактирование генома прямо в теле

Заболевание 44-летнего жителя Аризоны Брайана Мадо проявилось еще в раннем детстве. Оно неизлечимо и наследуют его в основном мужчины. Мукополисахаридоз II типа — это метаболическое расстройство: у людей с ним есть мутация в гене, ответственном за производство фермента, который участвует в расщеплении сложных углеводов. В итоге они накапливаются в клетках и вызывают многочисленные патологии органов.

Мужчина решил принять участие в клиническом испытании нового метода — генной терапии. Это лишь первая фаза исследования, а всего до регистрации терапии (то есть до разрешения применять этот метод для всех больных с синдромом Хантера) их должно быть три.

Метод, который использовали в случае Брайана Мадо, позволяет редактировать геном прямо в теле человека — и при этом достаточно точно попадать в конкретный участок ДНК. Редактирование происходит с помощью так называемых «цинковых пальцев». 

• Генетически модифицированные дети

Китайский исследователь Хэ Цзянькуй отредактировал геномы человеческих эмбрионов перед процедурой искусственного оплодотворения, в результате чего на свет появились двое детей с измененной ДНК.

С помощью системы CRISPR/Cas9 исследователь отредактировал геномы эмбрионов семи пар во время репродуктивного лечения. В результате одной из беременностей от здоровой матери и ВИЧ-инфицированного отца родились две девочки-двойняшки с измененной ДНК. Хэ Цзянькуй пояснил, что удалил у детей ген CCR5, благодаря чему они получили пожизненный иммунитет к ВИЧ.

• Возвращение зрения с помощью генной терапии

Для восстановления зрения можно использовать оптогенетические технологии, с помощью которых работой нейронов можно управлять с помощью светочувствительных белков бактерий и вспышек лазера.

Руководствуясь этой идеей, биологи создали вирус, который может проникать в ганглионарные нейроны. Эти нервные клетки отвечают за передачу сигналов из сетчатки в мозг человека. Попавший в ганглионарный нейрос вирус заставляет его производить подобные сигнальные молекулы. Однако эта процедура не возвращает зрение сама по себе, так как белки бактерий реагируют на свет не так, как палочки и колбочки сетчатки.

Чтобы решить эту проблему, профессор Базельского университета Ботонд Роска и профессор Питтсбургского университета Хосе Сахель создали специальные очки, которые преобразуют поступающие в них изображение в понятный мозгу формат и стимулируют ганглионарные клетки вспышками лазера. В результате пациент может видеть силуэты крупных предметов и объектов и совершать другие сложные действия

Читать далее:

Ученые проверили теорию панспермии на тихоходках: они могут путешествовать в космосе

Ученые выяснили, что сверхобогащенное золото образуется как простокваша

Крошечный водородный двигатель заменил аналоги на ископаемом топливе

В конце XX века тогда еще начинающие британские биохакеры совершили настоящий прорыв в генетике и предоставили любому человеку возможность с помощью ДНК-теста узнать больше о своих далеких предках и загадочной наследственности. Тогда, правда, только избранные могли объяснить, зачем и кому это нужно, — генетика была интересна лишь узкой группе специалистов, работающих с редкими заболеваниями. Но теперь за простым любопытством стоит более глобальная задача — разобраться в своей наследственности. А причина этому — надвигающийся тренд на тотальное оздоровление, исцеление и персонализированную медицину.

Сегодня эксперты уже не сомневаются в том, что генетика — основополагающая наука медицины будущего, хотя ее технологии и без того кажутся чем-то из мира научной фантастики. Перспективы развития генетики в России обсудят на площадках форума «БИОТЕХМЕД», который пройдет 16 и 17 сентября в Геленджике. В преддверии этого события «РБК Стиль» пообщался с одним из экспертов форума — врачом-генетиком Екатериной Захаровой — и узнал у нее, как работает ДНК, какие особенности мы можем унаследовать от родителей и безопасно ли вмешательство генетиков в организм.

Екатерина Захарова
Заведующая лабораторией наследственных болезней обмена веществ ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова», член экспертного совета по редким болезням при комитете Государственной думы по охране здоровья

Как устроена клетка

Со школьных времен всем известно, что организм человека состоит из множества клеток, в каждой из которых есть ядро — именно там хранится генетическая информация. Ее мы наследуем от родителей и дальше передаем своим детям. В материальном обличии эта информация представлена в виде той самой нити ДНК — дезоксирибонуклеиновой кислоты. Эта макромолекула была открыта достаточно давно, но то, что именно в ней хранится генетическая информация, стало известно только в XX веке.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — макромолекула, которая хранит и передает из поколения в поколение генетическую программу функционирования живых организмов. Биологическая информация в ДНК представлена в виде уникального генетического кода, состоящего из последовательности нуклеотидов.

Зачем нужна ДНК

Говоря о том, зачем нам ДНК и что она делает, можно привести аналогию: каждый белок в нашем организме синтезируется по определенному «рецепту». В нем указано, сколько должно быть аминокислот, в какой последовательности они будут соединяться и куда дальше последуют. В таком случае ДНК — это поваренная книга, в которой записаны рецепты всех наших белков, а мутация — это повреждение белка или изменение текста поваренной книги. Если в рецепте появляется опечатка, то белок получается «неправильный» и не выполняет свои функции должным образом, отчего страдает как клетка, так и весь организм, что приводит к развитию заболевания.

Во всех наших клетках хранятся одинаковые гены. Но функции у клеток разные: одни, например, синтезируют гемоглобин, другие занимаются мышечными белками, третьи — нервными. Это обеспечивается с помощью системы регуляции активности генов: она способна «включать» одни гены и оставлять в молчании другие.

Чем генетика отличается от наследственности

Генетика — большая и очень разнообразная наука. Клиническая генетика изучает, как проявляются наследственные болезни, популяционная — наше происхождение и особенности каждого народа. А вот наследственность — понятие уже более узкое. Люди давно заметили, что есть признаки, которые ярко проявляются у представителей одной семьи и передаются из поколения в поколение.

Если вспомнить живопись и портреты членов династии испанских Габсбургов, то многим сразу придут на ум их наследственные приметы: выступающая «габсбургская губа» и гипертрофированная нижняя челюсть, которая, говорят, даже мешала монарху нормально пережевывать пищу. Совершенно очевидно, что эти признаки связаны с изменениями определенных генов в известном роду.

Что еще хранится в ДНК

Информация, закодированная в ДНК, способна рассказать как о заболеваниях, так и о цвете волос, форме глаз, группе крови и даже вкусовых предпочтениях. Например, в ходе генетических исследований ученые обнаружили, что всех людей можно разделить на две категории: тех, кто любит капусту брокколи, и тех, кто ее просто ненавидит. Оказалось, что у второй группы есть определенные повреждения в гене, ответственные за восприятие этого вкуса, — им брокколи кажется горькой и неприятной.

В ДНК также могут быть записаны наши пагубные привычки, склонность к полноте или употреблению алкоголя. Изменения в некоторых генах делают нас более восприимчивыми к этим факторам. Но, как правило, за них отвечает не один, а сразу множество взаимосвязанных генов. Кроме того, врачи уверены, что более существенную роль в данном вопросе играют воспитание и другие социальные факторы.

Можно ли унаследовать интеллектуальные способности

Считается, что интеллектуальные и эмоциональные способности будущего ребенка определяются большим набором генов, и предсказать, какую именно комбинацию они составят, наука пока не в состоянии. Поэтому утверждать, что у гениальных родителей рождаются только гениальные дети, нельзя. Хотя такой миф до сих пор существует: некоторые женщины даже продолжают выбирать себе избранника, исходя из его интеллектуальных способностей, или искать какого-нибудь выдающегося донора — нобелевского лауреата.

Однако есть теория, согласно которой IQ будущего ребенка в большей степени определяется матерью, поскольку в тех областях мозга, которые отвечают за интеллект, чаще активируется ген, наследуемый от нее. А вот за эмоциональное состояние и характер чаще отвечает отец. И в этом случае нобелевский лауреат может оказаться не самым лучшим кандидатом на отцовство.

Как наследуются болезни

Болезни могут наследоваться по-разному. В некоторых случаях патология должна быть у одного из родителей, который, в свою очередь, передает ее детям (с вероятностью 50%). В других болезнь наследуется только по женской линии, и в итоге страдают ей мальчики, а девочки остаются ее здоровыми носительницами. Есть и заболевания, которые переносят оба родителя — у них больной ребенок может появиться на свет только в 25% случаев.

Кроме того, существует множество патологий, которые не наследуются, а появляются случайным образом. Например, в одной половой клетке матери или отца происходят изменения без особых на то причин, и в семье, где никогда не встречались с генетическими заболеваниями, может родиться малыш с синдромом Дауна (хромосомной патологией) или ахондроплазией — моногенным заболеванием, которое проявляется как карликовость. В такой ситуации одна из главных задач врача-генетика — выяснить, как наследуется болезнь, проинформировать семью о возможных рисках рождения больного ребенка, а также рассказать, что можно сделать, чтобы ребенок родился здоровым.

Наследуются ли онкологические заболевания

Большинство онкологических заболеваний — это мутации в генах. Однако они возникают не в половых, а в соматических клетках и не передаются по наследству. В таком случае на их развитие большое влияние оказывают именно внешние факторы: курение, радиация и канцерогенные химические вещества.

Но, к сожалению, есть отдельные виды онкозаболеваний, к которым приводит мутация в генах: они переходят от родителей к ребенку. Самый известный пример — рак молочной железы, за появление которого отвечают гены BRCA1 и BRCA2. В группу риска попадает подавляющее большинство девушек и женщин, у которых в семье были случаи рака молочной железы, поскольку наличие мутации в генах сильно повышает риск развития этого заболевания в определенном возрасте. Это означает, что рак может появиться вне зависимости от образа жизни, занятий спортом и сбалансированности рациона.

Как разгадать свои гены

Попытаться разобрать загадочную ДНК и узнать больше о своих генах можно при помощи генетических тестов. Как правило, их рекомендуют проводить в первую очередь тем семьям, где уже были зафиксированы случаи наследственных заболеваний. Но есть скрининг-тесты, которые проводятся для всех, вне зависимости от того, есть ли вероятность возникновения наследственного заболевания. Например, сейчас у всех беременных женщин есть возможность сдать анализы на определение генетических заболеваний у эмбриона. Скрининг на раннем сроке проводится специально для того, чтобы определить, входят ли будущая мама и ее малыш в группу риска. Дальше назначаются дополнительные обследования, которые подтверждают или опровергают развитие патологии. В ходе беременности не менее важно своевременно делать УЗИ, потому что пороки развития у плода встречаются намного чаще, чем любые наследственные заболевания.

Будущие родители должны осознавать, что комбинации их генов не всегда могут привести к идеальному результату. Но с некоторыми из наследственных патологий ребенок может жить совершенно нормально, поэтому пугаться их не стоит.

Может ли врач исправить наследственность

Если представить, что врач на начальном этапе сможет скомбинировать гены так, чтобы исправить недочеты в хромосомах будущего ребенка, родители, наверное, согласятся. Хотя стоит взять в расчет то, что часто двигателями прогресса, науки и искусства становятся именно неординарные люди. У талантливых художников, поэтов или музыкантов неоднократно были зафиксированы особенности развития, и если бы отбор по таким критериям существовал сотни лет назад, то мир лишился бы практически всех гениев.

Сейчас мы знаем многое о геноме человека и уже научились читать его последовательность. Но вот понять смысл этого «текста» можем далеко не всегда. Так же, как не всегда знаем, повлияет ли положительно наше вмешательство в структуру одного гена на работу других. Больше того, функция многих участков ДНК до сих пор остается не изучена.

ЭКО и дети из пробирки

Когда начинаешь работать с чем-то малоизвестным (а это часто встречается в генетике), всегда возникает вопрос о том, что делать правильно и этично, а что нет. Сегодня в цивилизованных странах накладывается запрет на генетические манипуляции с половыми клетками, потому что мы не знаем, как их изменения могут передаваться дальше и к каким последствиям это приведет. И, конечно, нельзя проводить эксперименты на живых эмбрионах.

Пока что в случае обнаружения какого-либо генетического заболевания врач может только предложить пренатальную или предимплантационную диагностику — метод, позволяющий произвести генетическую экспертизу одной клетки эмбриона перед процедурой ЭКО (экстракорпорального оплодотворения). Задача такой диагностики — предоставить возможность рождения здоровых детей в семьях, где существует высокий риск рождения ребенка с тяжелыми заболеваниями. Но у любых современных технологий, включая ЭКО, есть свои риски. Даже после подсадки эмбрион может не прижиться. При этом среди нас уже растет множество детей, которые появились благодаря искусственному оплодотворению, и они совершенно ничем не отличаются от обычных малышей.

Что происходит с эволюцией

В глобальном плане человеческие гены могут со временем мутировать и видоизменяться. И онкологические заболевания — одна из самых ярких иллюстраций этого процесса. Теперь, когда продолжительность жизни выросла, увеличилась и вероятность появления опухолей. С другой стороны, прогресс тоже не стоит на месте: появляется все больше методов диагностики и лечения, которые помогают справляться с тяжелыми недугами.

Еще до недавнего времени выявление генетических заболеваний было непростой задачей. Однако методы секвенирования уже позволяют «читать» ДНК не по одной букве-нуклеотиду, а разбирать все буквы одновременно. Так можно выявлять и мутации, передающиеся по наследству и новые, от появления которых не застрахован никто. Конечно, некоторые окружающие факторы тоже могут влиять на то, как ведут себя наши гены. Это и экология, и пища, и привычки. Их изучением наука тоже занимается активно.

Куда движется генетика

Генетика становится всеобъемлющей: по одной капле крови теперь можно определить все, что веками записывалось в ДНК человека. Вместо сотрудников диагностикой занимаются математические алгоритмы. Вполне возможно, что через некоторое время генетическая экспертиза станет обычным делом и без нее не будет обходиться даже рядовой прием у врача-терапевта.

И наверняка будет создаваться все больше препаратов, основанных на принципах персонализированной медицины, которые подбираются в зависимости от особенностей метаболизма пациента и его мутаций. Что же касается детей на заказ, то наука должна помогать нам корректировать гены только в случаях тяжелых наследственных заболеваний, а не для того, чтобы выбирать пол ребенка и цвет его глаз или особенности поведения. В этом вопросе нужно позволить природе комбинировать наши гены для появления на свет совершенно неповторимого чудесного существа — человека. 

Что на роду написано, того не миновать?
Редактирование генома в терапии наследственных заболеваний

Наследственность – это своего рода фатализм нашего времени. Расшифровка последовательности ДНК сродни предсказанию судьбы человека. Нам говорят, что гены определяют все: от цвета глаз до склонности к девиантному поведению. Добавьте к этому болезни, передающиеся по наследству, и мутации, связанные с риском развития таких болезней, как рак. Но можно ли пойти наперекор зловещему року и изменить судьбу, записанную на «скрижалях» ДНК? Да, это возможно, и если не сегодня, то в недалеком будущем. Генетическая инженерия занимается этими проблемами уже несколько десятков лет, однако в последние годы вокруг редактирования геномов возник особый ажиотаж. Что же изменилось? Ответ на этот вопрос – аббревиатура CRISPR/Cas

Все началось в 1987 г., когда в бактериальной ДНК были обнаружены странные нуклеотидные повторы, разделенные небольшими участками уникальных последовательностей. Спустя десять лет было показано, что эти повторенные последовательности, названные CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), являются системой адаптивного иммунитета бактерий – ​способом защиты против чужеродной ДНК, в частности, против бактериальных вирусов (бактериофагов).

Но какое отношение имеет это к наследственным болезням человека? Все дело в механизме действия системы CRISPR. Бактериофаги впрыскивают в клетку бактерии свою ДНК, которая многократно копируется и упаковывается в белковую оболочку за счет «хозяина» – ​таким образом на свет появляются новые бактериофаги. Защитная система бактерии, включающая белок-«ножницы» Cas, распознает чужую ДНК в случае, если она уже встречалась с ней раньше, и разрезает ее. Захватчики побеждены.

Узнавание мишени происходит по знаменитому принципу комплементарности, по которому образуются пары нуклеотидов в двуспиральной структуре ДНК. Этот принцип работает во всех живых организмах на нашей планете, включая клетки человека. Поэтому главное в механизме CRISPR/Cas – ​его простота и универсальность.

Знаковое событие случилось в 2012 г., когда была опубликована совместная работа француженки Э. Шарпентье и американки Д. Дудна, где было показано, что бактериальная система CRISPR/Cas может быть использована для внесения разрывов в последовательность любой ДНК, что свидетельствовало об ее огромном потенциале для редактирования геномов (Jinek et al., 2012). Ведь, зная нуклеотидную последовательность, можно внести разрыв в точно выбранное место любой ДНК.

Так в руках ученых оказался простой и эффективный инструмент, позволяющий направленно вносить изменения в ДНК живой клетки, т. е. переписывать те самые «скрижали». С тех пор вышли сотни научных статей, свидетельствующих о том, что эта система работает в самых различных видах организмов, позволяет вносить разрывы в любые последовательности генов, в том числе несущие мутации, вызывающие наследственные болезни (Немудрый, 2014).

Ремонтируем ДНК направленно

Но вот ДНК разрезана – ​что дальше? Дальше идет «ремонт» (репарация). Вообще разрывы в ДНК не такая уж и редкость: ежесуточно в каждой клетке человека под действием активных форм кислорода их возникает около 10 тысяч, и клетка их тщательно «штопает», восстанавливая целостность ДНК (Helbock et al., 1998). Но эти разрывы случайны, в отличие от действия CRISPR/Cas.

Существуют «терапевтические» мутации, предотвращающие развитие заболеваний. Например, мутации в гене CCR 5 предотвращают заражение клеток ВИЧ (Genovese et al., 2014, Liu et al., 1996), а мутация A673T в гене APP – ​развитие болезни Альцгеймера (Jonsson et al., 2012). С помощью системы CRISPR/Cas можно внести в геном необходимые изменения, «сломав» целевые гены либо внеся целевые замены (Cox et al., 2015)

Направленные разрывы, внесенные CRISPR/Cas, могут быть репарированы по-разному: существует несколько способов, отличающихся механизмом, точностью и т. п. В зависимости от пути репарации можно получить следующие результаты. Во-первых, «сломать» ген, если при репарации ДНК произойдет мутация. Такого эффекта можно добиться, если репарация произойдет, например, по механизму соединения негомологичных концов, для которого характерна неточность. Также возможно добиться крупной делеции (утраты фрагмента ДНК) и удалить участок либо целый ген.

Во-вторых, можно «переписать» определенную последовательность ДНК в клетке. Как известно, при репарации разрывов по пути гомологичной рекомбинации восстановление поврежденного участка ДНК идет по шаблону сестринской хромосомы (в клетках у нас присутствует по две копии каждой хромосомы – ​от отца и от матери). Фокус в том, что клетку можно обмануть, «подсунув» ей вместо сестринской хромосомы искусственно созданную «донорную» ДНК. Если такая ДНК будет «похожа» на поврежденный участок, то клетка может использовать ее в качестве образца.

Сестринская хромосома присутствует в клетке в единичном экземпляре, а копий «донорной» ДНК можно доставить множество, что дает искусственной ДНК конкурентное преимущество, пусть она и отличается немного от поврежденного участка. Таким образом можно «исправить», к примеру, мутацию, или вставить небольшой новый фрагмент ДНК.

И вот здесь мы вплотную подходим к терапии генетических заболеваний. Начнем с того, что все такие патологии отличаются друг от друга: они вызваны мутациями в разных генах, да и сами мутации могут иметь различную природу и давать разный эффект в одном и том же гене. Соответственно, есть разные варианты применения геномного редактирования: ген можно «сломать» или просто удалить мутантный участок, «исправить» мутацию или, напротив, добавить в геном полезные «терапевтические» мутации или даже новый дополнительный трансген.

В теории все это выглядит прекрасно, но вот в чем вопрос: в организме взрослого человека имеются десятки триллионов клеток, и в каждой из них содержится мутантный ген. Как эти подходы применить на практике? Как лечить реального пациента?

Работаем «в пробирке» и в организме

На самом деле в большинстве случаев нет нужды исправлять мутацию в каждой клетке организма. Например, серповидноклеточная анемия вызвана мутациями в гене, кодирующем субъединицу гемоглобина, что приводит к дисфункции только клеток крови – ​эритроцитов. А наследственные нейродегенеративные заболевания, например боковой амиотрофический склероз, связаны с гибелью нейронов определенных типов. Таким образом, мишенями для терапии многих генетических заболеваний могут быть клетки лишь определенных органов или тканей, где специфично синтезируются/не синтезируются продукты мутантных генов.

Суть редактирования геномов ex vivo («вне живого») заключается во введении в организм «здоровых» клеток, в которых, к примеру, будет синтезироваться нужный белок. Но если вводить клетки, взятые даже от здорового донора, то организм пациента с большой вероятностью их отторгнет. Поэтому нужно взять клетки самого пациента и изменить в них мутантный ген, а потом ввести их обратно. Наиболее разработан этот подход для заболеваний крови, поскольку забор и пересадка костного мозга, где идет кроветворение, практикуется с 1959 г.

Но что делать в случае, если «дефектные» клетки не так просто получить? Например, если болезнь проявляется в головном мозге? Вдобавок не все типы клеток способны пережить все процедуры в чашке Петри вне организма. Здесь на помощь приходит другая крайне перспективная технология нашего времени, связанная с получением так называемых индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Плюрипотентные стволовые клетки бессмертны: теоретически они могут делиться бесконечно и при действии определенных стимулов образовывать любые клетки тканей и органов взрослого организма. Используя необходимый набор стимулов, можно направить развитие стволовых клеток в определенный тип клеток, например, в нейроны. Этот процесс называют направленной дифференцировкой

Относительно простой и эффективный способ получения стволовых клеток из клеток кожи в результате репрограммирования был изобретен в 2006 г. японскими исследователями К. Такахаси и С. Яманака (Takahashi & Yamanaka, 2006). Таким образом, появился метод вернуть практически любую клетку организма (крови, кожи, жировой ткани и т. д.) в состояние стволовой.

Возможность использования ИПСК для клеточной терапии наследственных заболеваний была впервые продемонстрирована на модели серповидноклеточной анемии (Hanna et al., 2007). В геном лабораторных мышей были встроены мутантные гены человека, приводящие к развитию этой болезни.

Из клеток кожи этих животных были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, в которых мутация была исправлена с помощью гомологичной рекомбинации. Путем направленной дифференцировки из этих клеток были получены стволовые предшественницы клеток крови, которые трансплантировали в организм животных. Последние не только прижились, но и превратились в здоровые эритроциты. Лечение оказалось успешным.

С тех пор cписок наследственных болезней, для которых успешно был опробован этот подход, пополнился десятками наименований и продолжает расти.

Но зачем тратить время и деньги на извлечение и культивирование клеток, если можно все сделать прямо «на месте»? Ведь система CRISR/Cas в силу своей универсальности теоретически способна работать непосредственно в клетках живого организма. Главная проблема – ​это эффективно и безопасно доставить элементы этой системы в нужное место.

Сегодня наиболее часто для доставки генов CRISPR/Cas в организм используются вирусные частицы. В качестве таких носителей обычно выступают аденоассоциированные вирусы – ​дефектные вирусы, способные размножаться только в присутствии «помощников»-аденовирусов. Эти вирусы эффективно заражают клетки человека, но не вызывают у него никаких патологий. А вирусные частицы, в геном которых встроены гены CRISPR/Сas, после заражения уже не могут размножаться. При этом разные серотипы этих вирусов имеют «склонность» к разным тканям. Например, серотип AAV8 предпочитает ткани печени, а уже сегодня можно создать искусственные серотипы, нацеленные на любой орган.

Активно развиваются и невирусные способы доставки, например, упаковка готовых молекулярных комплексов РНК-белок в липосомы (липидные пузырьки) или полимерные частицы. Это более безопасно, а также обеспечивает более строгий контроль над дозой.

Это все здорово, но…

Всегда есть это «но». Технология CRISPR/Cas начала применяться для редактирования геномов млекопитающих пять лет назад. На сегодня получено колоссальное количество данных, достигнут огромный прогресс на пути к клиническому применению, но все же остается ряд вопросов, которые необходимо будет решить для каждого конкретного генетического заболевания. Например, какая доставка будет оптимальна? Приживутся ли введенные клетки? Какова будет эффективность и безопасность лечения? И etc. …

Возьмем для примера пару вопросов из этого списка и посмотрим, какие конкретные ответы на них уже получены в научном сообществе. Одна из проблем использования CRISPR/Cas связана с возможностью нецелевых эффектов: система может вносить разрывы в участки, отличающиеся от целевого на несколько «букв» – ​нуклеотидов, что чревато риском возникновения нежданных мутаций. Особенно остро вопрос безопасности стоит при редактировании геномов in vivo, когда проверить результат предварительно невозможно.

Для решения этой проблемы лидирующие группы ученых под руководством Д. Дудны, Ф. Чжана и К. Джуна независимо друг от друга создали мутантные «улучшенные» варианты белка Cas9 с повышенной специфичностью, частота нецелевых эффектов которых упала на несколько порядков.

С помощью технологии геномного редактирования можно не только лечить наследственные заболевания, но и создавать «дизайнерских» детей. Ведь если можно исправить ген, вызывающий болезнь, то почему бы не изменить ген, регулирующий цвет глаз, продолжительность жизни, наконец, интеллект? Уже сегодня в Китае с помощью CRISPR/Cas выведены собаки породы бигль, у которых «выключен» ген, кодирующий миостатин – фактор, подавляющий рост мышечной ткани. В результате эти животные отличаются повышенной мускулистостью. А что мешает «выключить» этот ген в эмбрионе человека?

Что касается эффективности терапии, то все зависит от особенностей самого заболевания и мутации, его вызывающей. Возможны три варианта: после исправления мутации жизнеспособность клеток увеличится, не изменится или ухудшится. В первом случае исправленные клетки получают конкурентное преимущество и могут постепенно заместить мутантные. Например, на линии мышей с наследственным заболеванием печени – ​тирозинемией I типа – ​было показано, что при системной доставке CRISPR/Cas непосредственно в организм животного мутация «исправляется» в 6 % клеток печени. Даже такого небольшого количества клеток достаточно, чтобы предотвратить падение веса и привести в норму биохимические показатели печени животных. А более жизнеспособные клетки с исправленной мутацией начинают «обживать» печень.

Но, к примеру, в случае гемофилии B жизнеспособность клеток после исправления мутации не повышается. Тем не менее уже 3—7 % клеток печени, продуцирующих нормальный фактор свертывания крови, достаточно для устойчивого терапевтического эффекта (Ohmori et al., 2017).

Что же касается исправления мутаций в онкогенах, то жизнеспособность и скорость пролиферации таких клеток будет снижаться относительно раковых, поэтому эффективность подобной терапии вызывает сомнения.

Тем не менее пример гемофилии B показывает, что если заболевание связано с отсутствием какого-то фермента или гормона, то небольшого числа клеток, его продуцирующих, может хватить, по крайней мере, для перевода болезни в более мягкую форму, а в некоторых случаях и для полного восстановления утраченных функций.

Классическими же модельными заболеваниями в исследованиях по терапии с помощью геномного редактирования являются гемоглобинопатии и мышечная дистрофия Дюшенна. Именно на этих заболеваниях была подтверждена работоспособность концепций такого лечения, показано, что клетки с исправленной мутацией демонстрируют «здоровый» фенотип. В случае мышечной дистрофии Дюшенна такие клетки не только успешно встраивались в мышечную ткань взрослых мышей, но и улучшали функциональные показатели всей мышцы в целом.

Система CRISPR/Cas9 открывает перед человечеством большие перспективы, но нужно понимать, что это не волшебная палочка для решения всех проблем, а инструмент, такой, как, например, молоток. И нужно учиться применять этот инструмент для каждой конкретной задачи.

Главный шаг, который уже был сделан в этой области, – ​это выход за пределы лабораторий. Уже существует ряд компаний, занимающихся внедрением технологии CRISPR/Cas в практику, и не только медицинскую. Этот подход, к примеру, используется сегодня для получения модифицированных микробов для нужд биотехнологии и модифицированных растений.

Можно ожидать, что уже в ближайшее десятилетие новая технология найдет и клиническое применение. Так, в 2016 г. в Китае стартовали первые клинические испытания нового метода иммунотерапии метастазирующего немелкоклеточного рака легкого, в котором используются T-лимфоциты с «отредактированным» геномом.

С. М. ЗАКИЯН: «НАМ БЫЛ БРОШЕН ВЫЗОВ, И МЫ ДОЛЖНЫ НА НЕГО ОТВЕТИТЬ!» Исследования по применению системы CRISPR/Cas для терапии наследственных заболеваний начались в лаборатории эпигенетики развития ИЦиГ СО РАН под руководством С. М. Закияна в 2013 г., буквально сразу после выхода первых публикаций на эту тему.

Исследования ведутся на лабораторных крысах линии Brattleboro – ​модели генетически детерминированного заболевания, при котором наблюдается дефицит гормона аргинин-вазопрессина. В результате у животных развивается наследственный несахарный диабет с характерным для него чрезмерным потреблением жидкости. На сегодня уже получена линия клеток с исправленной мутацией в гене, кодирующем этот гормон.

В данном случае задача усложнялась тем, что ген вазопрессина по последовательности нуклеотидов схож с геном другого гормона – ​окситоцина. Более того, на участке, в котором возникла мутация у крыс Brattleboro, эти гены практически идентичны. Тем не менее удалось добиться специфичного действия CRISPR/Cas в гене вазопрессина без нецелевых двунитевых разрывов ДНК в гене окситоцина. На следующем этапе предполагается вводить исправленные клетки в организм животных для оценки терапевтического эффекта

Возможности, которые дает нам технология CRISPR/Cas, пугающие и захватывающие одновременно. Сначала китайские исследователи, а затем их коллеги из США смогли внести изменения в эмбрионы человека. Недавно группа американских ученых под руководством Ш. Миталипова «исправила» в человеческом эмбрионе мутацию, вызывающую гипертрофическую кардиомиопатию (Ma et al., 2017). Эти эмбрионы были получены специально в результате искусственного оплодотворения, для которого были использованы здоровая яйцеклетка и сперматозоиды носителя мутации. Согласно современным нормам, зародыши были выведены из эксперимента на стадии бластоцисты. Однако с помощью современных репродуктивных технологий уже сегодня можно было бы имплантировать такие эмбрионы суррогатным матерям.

И здесь возникает очень серьезный этический вопрос: имеем ли мы право вмешиваться в ДНК человека? Или, наоборот, этично ли бездействовать, обрекая будущего ребенка на страдания?

Генетические изменения, внесенные в эмбрионы, сохранятся во всех клетках взрослого организма, и, соответственно, будут передаваться по наследству. Какой эффект окажет распространение таких модифицированных генов на человеческую популяцию в эволюционном аспекте, не говоря уже о риске возникновения новых евгенических движений?

Именно поэтому Д. Дудна, имеющая колоссальный авторитет в научном мире, призывает своих коллег не торопиться с применением этой технологии на эмбрионах человека, пока не будут разработаны международные этические и законодательные нормы для ее регулирования. В наши дни по всему миру проходят встречи, конференции, конгрессы и симпозиумы, на которых обсуждается будущее CRISPR/Cas. Возможно, от решений, которые будут приняты на них сейчас, зависят судьба человечества и то, как будет выглядеть наш мир в будущем.

В сентябре 2018 г. в новосибирском Академгородке также планируется провести международный конгресс по современным технологиям редактирования геномов, на котором будет обсуждаться технология CRISPR/Cas и, в частности, ее будущее в Российской Федерации.

Литература

Немудрый А. А., Валетдинова К. Р., Медведев С. П. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas – инструменты открытий // Acta Naturae. 2014. Т. 6. № 3(22). С. 20—42.

Cox D. B., Platt R. J., Zhang F. Therapeutic genome editing: prospects and challenges // Nat Med. 2015. V. 21. N. 2. P. 121—131.

Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity // Science. 2012. V. 337. N. 6096. P. 816—821.

Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S. W. et al. Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos // Nature. 2017. V. 548. N. 7668. P. 413—419.

From Wikipedia, the free encyclopedia

Human genetic enhancement or human genetic engineering refers to human enhancement by means of a genetic modification. This could be done in order to cure diseases (gene therapy), prevent the possibility of getting a particular disease^[1] (similarly to vaccines), to improve athlete performance in sporting events (gene doping), or to change physical appearance, metabolism, and even improve physical capabilities and mental faculties such as memory and intelligence.
These genetic enhancements may or may not be done in such a way that the change is heritable (which has raised concerns within the scientific community).^[2]

Gene therapy[edit]

Genetic modification in order to cure genetic diseases is referred to as gene therapy. Many such gene therapies are available, made it through all phases of clinical research and are approved by the FDA. Between 1989 and December 2018, over 2,900 clinical trials were conducted, with more than half of them in phase I.^[3] As of 2017, Spark Therapeutics’ Luxturna (RPE65 mutation-induced blindness) and Novartis’ Kymriah (Chimeric antigen receptor T cell therapy) are the FDA’s first approved gene therapies to enter the market. Since that time, drugs such as Novartis’ Zolgensma and Alnylam’s Patisiran have also received FDA approval, in addition to other companies’ gene therapy drugs. Most of these approaches utilize adeno-associated viruses (AAVs) and lentiviruses for performing gene insertions, in vivo and ex vivo, respectively. ASO / siRNA approaches such as those conducted by Alnylam and Ionis Pharmaceuticals require non-viral delivery systems, and utilize alternative mechanisms for trafficking to liver cells by way of GalNAc transporters.

Disease prevention[edit]

Some people are immunocompromised and their bodies are hence much less capable of fending off and defeating diseases (i.e. influenza, …). In some cases this is due to genetic flaws^{[clarification needed]} or even genetic diseases such as SCID. Some gene therapies have already been developed or are being developed to correct these genetic flaws/diseases, hereby making these people less susceptible to catching additional diseases (i.e. influenza, …).^[4]

In November 2018, Lulu and Nana were created.^[5] By using clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas9, a gene editing technique, they disabled a gene called CCR5 in the embryos, aiming to close the protein doorway that allows HIV to enter a cell and make the subjects immune to the HIV virus.

Gene doping[edit]

Athletes might adopt gene therapy technologies to improve their performance.^[6] Gene doping is not known to occur, but multiple gene therapies may have such effects. Kayser et al. argue that gene doping could level the playing field if all athletes receive equal access. Critics claim that any therapeutic intervention for non-therapeutic/enhancement purposes compromises the ethical foundations of medicine and sports.^[7]

Other uses[edit]

Other hypothetical gene therapies could include changes to physical appearance, metabolism, mental faculties such as memory and intelligence, and well-being (by increasing resistance to depression or relieving chronic pain, for example).^[8][9]

Physical appearance[edit]

Some congenital disorders (such as those affecting the muscoskeletal system) may affect physical appearance, and in some cases may also cause physical discomfort. Modifying the genes causing these congenital diseases (on those diagnosed to have mutations of the gene known to cause these diseases) may prevent this.

Also changes in the mystatin gene^[10] may alter appearance.

Behavior[edit]

Behavior may also be modified by genetic intervention.^[11] Some people may be aggressive, selfish, and may not be able to function well in society.^{[clarification needed]} There is currently research ongoing on genes that are or may be (in part) responsible for selfishness (e.g. ruthlessness gene), aggression (e.g. warrior gene), altruism (e.g. OXTR, CD38, COMT, DRD4, DRD5, IGF2, GABRB2^[12])

There is some research going on on the hypothetical treatment of psychiatric disorders by means of gene therapy. It is assumed that, with gene-transfer techniques, it is possible (in experimental settings using animal models) to alter CNS gene expression and thereby the intrinsic generation of molecules involved in neural plasticity and neural regeneration, and thereby modifying ultimately behaviour.^[13]

In recent years, it was possible to modify ethanol intake in animal models. Specifically, this was done by targeting the expression of the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2), lead to a significantly altered alcohol-drinking behaviour.^[14] Reduction of p11, a serotonin receptor binding protein, in the nucleus accumbens led to depression-like behaviour in rodents, while restoration of the p11 gene expression in this anatomical area reversed this behaviour.^[15]

Recently, it was also shown that the gene transfer of CBP (CREB (c-AMP response element binding protein) binding protein) improves cognitive deficits in an animal model of Alzheimer’s dementia via increasing the expression of BDNF (brain-derived neurotrophic factor).^[16] The same authors were also able to show in this study that accumulation of amyloid-β (Aβ) interfered with CREB activity which is physiologically involved in memory formation.

In another study, it was shown that Aβ deposition and plaque formation can be reduced by sustained expression of the neprilysin (an endopeptidase) gene which also led to improvements on the behavioural (i.e. cognitive) level.^[17]

Similarly, the intracerebral gene transfer of ECE (endothelin-converting enzyme) via a virus vector stereotactically injected in the right anterior cortex and hippocampus, has also shown to reduce Aβ deposits in a transgenic mouse model of Alzeimer’s dementia.^[18]

There is also research going on on genoeconomics, a protoscience that is based on the idea that a person’s financial behavior could be traced to their DNA and that genes are related to economic behavior. As of 2015, the results have been inconclusive. Some minor correlations have been identified.^[19][20]

Databases about potential modifications[edit]

George Church has compiled a list of potential genetic modifications based on scientific studies for possibly advantageous traits such as less need for sleep, cognition-related changes that protect against Alzheimer’s disease, disease resistances, higher lean muscle mass and enhanced learning abilities along with some of the associated studies and potential negative effects.^[21][22]

See also[edit]

• Biohappiness
• Crossbreeding
• Directed evolution (transhumanism)
• Designer baby
• Epigenetics
• Genetic screening: allows detecting personal genetic weaknesses to be addressed
• Genetic factors of addiction
• Procreative beneficence
• New eugenics
• Life extension

References[edit]

From Wikipedia, the free encyclopedia

Human genetic enhancement or human genetic engineering refers to human enhancement by means of a genetic modification. This could be done in order to cure diseases (gene therapy), prevent the possibility of getting a particular disease^[1] (similarly to vaccines), to improve athlete performance in sporting events (gene doping), or to change physical appearance, metabolism, and even improve physical capabilities and mental faculties such as memory and intelligence.
These genetic enhancements may or may not be done in such a way that the change is heritable (which has raised concerns within the scientific community).^[2]

Gene therapy[edit]

Genetic modification in order to cure genetic diseases is referred to as gene therapy. Many such gene therapies are available, made it through all phases of clinical research and are approved by the FDA. Between 1989 and December 2018, over 2,900 clinical trials were conducted, with more than half of them in phase I.^[3] As of 2017, Spark Therapeutics’ Luxturna (RPE65 mutation-induced blindness) and Novartis’ Kymriah (Chimeric antigen receptor T cell therapy) are the FDA’s first approved gene therapies to enter the market. Since that time, drugs such as Novartis’ Zolgensma and Alnylam’s Patisiran have also received FDA approval, in addition to other companies’ gene therapy drugs. Most of these approaches utilize adeno-associated viruses (AAVs) and lentiviruses for performing gene insertions, in vivo and ex vivo, respectively. ASO / siRNA approaches such as those conducted by Alnylam and Ionis Pharmaceuticals require non-viral delivery systems, and utilize alternative mechanisms for trafficking to liver cells by way of GalNAc transporters.

Disease prevention[edit]

Some people are immunocompromised and their bodies are hence much less capable of fending off and defeating diseases (i.e. influenza, …). In some cases this is due to genetic flaws^{[clarification needed]} or even genetic diseases such as SCID. Some gene therapies have already been developed or are being developed to correct these genetic flaws/diseases, hereby making these people less susceptible to catching additional diseases (i.e. influenza, …).^[4]

In November 2018, Lulu and Nana were created.^[5] By using clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-Cas9, a gene editing technique, they disabled a gene called CCR5 in the embryos, aiming to close the protein doorway that allows HIV to enter a cell and make the subjects immune to the HIV virus.

Gene doping[edit]

Athletes might adopt gene therapy technologies to improve their performance.^[6] Gene doping is not known to occur, but multiple gene therapies may have such effects. Kayser et al. argue that gene doping could level the playing field if all athletes receive equal access. Critics claim that any therapeutic intervention for non-therapeutic/enhancement purposes compromises the ethical foundations of medicine and sports.^[7]

Other uses[edit]

Other hypothetical gene therapies could include changes to physical appearance, metabolism, mental faculties such as memory and intelligence, and well-being (by increasing resistance to depression or relieving chronic pain, for example).^[8][9]

Physical appearance[edit]

Some congenital disorders (such as those affecting the muscoskeletal system) may affect physical appearance, and in some cases may also cause physical discomfort. Modifying the genes causing these congenital diseases (on those diagnosed to have mutations of the gene known to cause these diseases) may prevent this.

Also changes in the mystatin gene^[10] may alter appearance.

Behavior[edit]

Behavior may also be modified by genetic intervention.^[11] Some people may be aggressive, selfish, and may not be able to function well in society.^{[clarification needed]} There is currently research ongoing on genes that are or may be (in part) responsible for selfishness (e.g. ruthlessness gene), aggression (e.g. warrior gene), altruism (e.g. OXTR, CD38, COMT, DRD4, DRD5, IGF2, GABRB2^[12])

There is some research going on on the hypothetical treatment of psychiatric disorders by means of gene therapy. It is assumed that, with gene-transfer techniques, it is possible (in experimental settings using animal models) to alter CNS gene expression and thereby the intrinsic generation of molecules involved in neural plasticity and neural regeneration, and thereby modifying ultimately behaviour.^[13]

In recent years, it was possible to modify ethanol intake in animal models. Specifically, this was done by targeting the expression of the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH2), lead to a significantly altered alcohol-drinking behaviour.^[14] Reduction of p11, a serotonin receptor binding protein, in the nucleus accumbens led to depression-like behaviour in rodents, while restoration of the p11 gene expression in this anatomical area reversed this behaviour.^[15]

Recently, it was also shown that the gene transfer of CBP (CREB (c-AMP response element binding protein) binding protein) improves cognitive deficits in an animal model of Alzheimer’s dementia via increasing the expression of BDNF (brain-derived neurotrophic factor).^[16] The same authors were also able to show in this study that accumulation of amyloid-β (Aβ) interfered with CREB activity which is physiologically involved in memory formation.

In another study, it was shown that Aβ deposition and plaque formation can be reduced by sustained expression of the neprilysin (an endopeptidase) gene which also led to improvements on the behavioural (i.e. cognitive) level.^[17]

Similarly, the intracerebral gene transfer of ECE (endothelin-converting enzyme) via a virus vector stereotactically injected in the right anterior cortex and hippocampus, has also shown to reduce Aβ deposits in a transgenic mouse model of Alzeimer’s dementia.^[18]

There is also research going on on genoeconomics, a protoscience that is based on the idea that a person’s financial behavior could be traced to their DNA and that genes are related to economic behavior. As of 2015, the results have been inconclusive. Some minor correlations have been identified.^[19][20]

Databases about potential modifications[edit]

George Church has compiled a list of potential genetic modifications based on scientific studies for possibly advantageous traits such as less need for sleep, cognition-related changes that protect against Alzheimer’s disease, disease resistances, higher lean muscle mass and enhanced learning abilities along with some of the associated studies and potential negative effects.^[21][22]

See also[edit]

• Biohappiness
• Crossbreeding
• Directed evolution (transhumanism)
• Designer baby
• Epigenetics
• Genetic screening: allows detecting personal genetic weaknesses to be addressed
• Genetic factors of addiction
• Procreative beneficence
• New eugenics
• Life extension

References[edit]

Введение

Актуальность данной работы обусловлена стремительным развитием молекулярной генетики и созданных ею генетических технологий. Расширились возможности генной терапии заболеваний, появились методы редактирования геномов, в том числе генома человека [1, 2]. Современные геномные технологии позволили лечить заболевания, считавшиеся ранее неизлечимыми, способствовали развитию персонализированного подхода к диагностике заболевания и лечению пациента с учетом индивидуальных характеристик его генома [3].

Методы генной инженерии

Генная инженерия позволила создавать определенные геномные конструкции бактерий, но испытывала нехватку методов при работе с геномами высших организмов. Подходы к редактированию генома человека появились лишь в конце прошлого века. С целью обеспечения адресной доставки гена в клетки-мишени стали использовать рекомбинантные носители (векторы), чаще всего сконструированные на основе вирусов, подвергшихся специальной модификации с целью повышения их безопасности для человека. Чаще всего применяются рекомбинантные аденовирусы, ретровирусы, аденоассоциированные вирусы, лентивирусы и ряд других [4–7].

Путем введения модификаций в геном ретровируса, т. е. вставки измененных человеческих генов, можно добиться внедрения в геном хозяина таких элементов. Однако отсутствие специфичности встраивания являлось существенным недостатком. Поэтому находкой стал разработанный в 2012–2013 гг. метод редактирования генома CRISPR/Cas, в основе которого лежит способ защиты бактерий от вирусов-бактериофагов, выражающийся в избирательном расщеплении его ДНК, своеобразный «иммунитет» бактерий [8, 9]. В 2020 г. Д. Дудна и Э. Шарпантье за разработку данного метода в применении к клеткам человека удостоены Нобелевской премии по химии. Сначала на бактерии Streptococcus pyogenes они установили, как работает белок Cas9, а позднее показали, что с помощью этого механизма можно разрезать в адресной точке любую молекулу ДНК, в том числе и ДНК человека [8].

Создание системы CRISPR/Cas немедленно явилось мощным стимулом ее использования в России. Внедрение новой технологии произвело революцию в области генетической терапии, поскольку она позволяет намного более точно редактировать ген, чем ранее описанные инструменты, проверить ее на животных моделях и вплотную подступить к лечению генетических заболеваний у людей [7]. В настоящее время подробно описан механизм CRISPR/Cas9, включая его биохимические и структурные последствия, выделены последние улучшения в системе CRISPR/Cas9, особенно модификации белка Cas9 для настройки, рассмотрены современные приложения, в которых использовалась универсальная система CRISPR/Cas9 для редактирования генома, эпигенома или РНК различных организмов [3, 9]. С помощью CRISPR/Cas можно вносить точечные мутации, встраивать в определенные места новые гены или, наоборот, удалять участки нуклеотидных последовательностей, исправлять или заменять фрагменты генов. В современных обзорах представлено изучение технических аспектов, областей применения и перспектив этой технологии в различных областях [3, 7, 9].

Другие способы модификаций генома связаны с технологиями ZFN и TALEN [1], основанными на природных свойствах определенных белков, называемых нуклеазами. Эти ферменты умеют проводить специфическое вырезание участка исходного генома и встраивание в место разреза привнесенного с собой фрагмента исправленной ДНК. Такой способ позволяет проводить целевую модификацию нарушенных генов, гораздо более точную, чем просто ретровирусная. Отличие ZFN и TALEN заключается в использовании разных видов ферментов, но итог их работы примерно одинаков. ZFN и TALEN не нашли массового применения в медицине, прежде всего из-за трудоемкости метода. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок Cas9, вносящий разрыв в ДНК, а РНК-гид, узнающую мишень на простом принципе комплементарного узнавания нуклеиновых кислот, можно создать за короткое время. Это новый уровень редактирования, более дешевый и точный. В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 можно лечить моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, какие именно гены нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие многофакторные болезни — сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов, для лечения потребуются комплексные подходы [10].

Разделяют два способа воздействия генных конструкций на клетки-мишени — in vivo и ex vivo [11]. В первом случае — непосредственно на тканях живого организма с использованием адресной доставки нуклеиновых кислот и преодолением сложных проблем, связанных с быстрой деградацией чужеродного биологического материала. Во втором случае воздействие основано на генотерапевтической модификации вне организма стволовых клеток, клеток крови, костного мозга и др. с последующим их возвратом в системный кровоток или пораженный орган. Используя систему CRISPR/Cas9, можно было бы получить образец костного мозга пациента и вылечить его собственные кроветворные стволовые клетки и затем ввести их в организм, предварительно устранив с помощью облучения собственные пораженные кроветворные клетки. Они начнут делиться и производить здоровые кровяные клетки. Если же речь идет о редактировании, например, генов клеток опухоли печени, все гораздо сложнее. Нужно будет решить проблему доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы именно к пораженным клеткам. Хотя многие исследования показали, что технология CRISPR/Cas9 является более эффективной, специфичной и управляемой, чем предыдущие поколения инструментов редактирования генов, ее можно еще улучшить, повысив ее общую эффективность при более высокой частоте модификаций генома и уменьшив ее нецелевые эффекты. Уже рассматривается развитие технологии CRISPR/Cas9 с особым вниманием к повышению специфичности его последовательности, уменьшению нецелевых эффектов и систем доставки [12]. В данном обзоре представлены примеры недавнего успешного применения технологии CRISPR/Cas9 в лабораторных и клинических исследованиях.

Открытие возможности перепрограммирования зрелых клеток человека и разработка инженерных эндонуклеаз для улучшения редактирования генома являются двумя наиболее впечатляющими и эффективными технологическими достижениями в современной медицине и науке [13]. У индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека (ИПСК) есть потенциал для создания новых модельных систем для изучения биологии развития человека, механизмов заболеваний и тестирования лекарственных препаратов. Коррекция генов в специфических для пациента ИПСК может стать новым источником для заместительной клеточной терапии [14]. Инструменты редактирования генома уже произвели революцию в биомедицинских исследованиях, в настоящее время ожидается их применение в клинике. Тем не менее широкое использование данных методов в исследованиях выявило большую непредсказуемость эффектов, необходимость обширной проверки моделей, молекулярного обоснования соотношения риска и пользы. Проблемы эти широко обсуждаются [15].

Другие наиболее часто применяемые методы генной терапии — использование антисмысловых нуклеотидов как в эксперименте, так и в клинике, метод генного «глушения», или генный сайленсинг, метод выключения генов, основанный на РНК-интерференции, использование для модуляции экспрессии генов микроРНК [16, 17]. Развивается применение оптогенетической геномной инженерии для создания животных моделей, в частности для получения генетически модифицированных мышей для биомедицинских исследований [18]. Высокоэффективная технология обеспечивает эффективную рекомбинацию ДНК, которая активируется при освещении синим светом с пространственно-временной точностью. Создана фотоактивируемая модель мыши с нокаутированной рекомбиназой Cre-loxP (мыши TRE-PA-Cre) с использованием системы CRISPR/Cas9. Модель обещает быть полезной для оптогенетической инженерии генома неинвазивным и специфичным для типа клеток методом in vivo. Особое место среди методов генной терапии занимает ДНК-вакцинация, по сравнению с традиционными вакцинами она дает возможность индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа, отличается низкой эффективной дозой, а также отсутствием вирулентности, простотой и быстротой получения высоких доз вакцины, высокой устойчивостью и удобством хранения [2].

Применение технологий в клинической практике

Нейромышечные заболевания

Удалось показать, что внутривенная генная терапия с помощью вектора AAV9 может остановить спинальную мышечную атрофию 1 типа (SMA1) — прогрессирующее моногенное заболевание двигательных нейронов, которое возникает в младенчестве, что приводит к неспособности к движению и смерти или необходимости искусственной вентиляции легких в возрасте до 2 лет. Ученым удалось осуществить функциональную замену мутантного гена фактора выживаемости мотонейронов-1 (SMN1). В ноябре 2017 г. межнациональная группа специалистов и компания AveXis сообщили о том, что однократное внутривенное введение аденоассоциированного вирусного вектора, содержащего ДНК, кодирующую SMN, пациентам с SMA1 обусловило более длительное выживание и лучшую моторную функцию, чем в контрольных когортах [19].

Крупным прорывом в области генной терапии стало сообщение о том, что ученые-клиницисты сохранили жизнь девочке, родившейся с фатальным наследственным нейромышечным заболеванием SMA1, путем введения отсутствующего гена в ее спинальные нейроны. В 8 нед. она прошла курс генной терапии, который дал ее организму критически недостающий белок. Результаты испытания, в котором участвовала маленькая пациентка, явились одним из самых впечатляющих успехов в некогда проблемной области, поскольку исследователи впервые провели новый ген через гематоэнцефалический барьер [20]. Успешный клинический исход эксперимента позволил надеяться на применение генной терапии в лечении других нейрозаболеваний путем доставки генов в таргетные клетки с помощью векторов на основе аденоассоциированного вируса.

Мышечная дистрофия Дюшенна является одним из наиболее распространенных наследственных генетических заболеваний и вызвана мутациями в гене DMD, который кодирует белок дистрофин. Недавние успехи в редактировании генома и генной терапии дают надежду на развитие потенциальной терапии. Укороченные версии гена DMD могут доставляться в пораженные ткани с вирусными векторами и уже продемонстрировали многообещающие результаты на различных моделях животных. Редактирование генома с помощью системы CRISPR/Cas9 было использовано для восстановления экспрессии дистрофина путем делеций одного или нескольких экзонов гена DMD в клетках пациента и на мышиной модели. Более подробно применяемые технологии и их развитие рассмотрены в обзорах, где представлены последние достижения и перспективы по трем основным подгруппам терапии дистрофии Дюшенна, включая генную терапию, клеточную терапию и фармакологическую терапию [21–23].

Онкологические заболевания

Опухоли остаются проблемой для здоровья во всем мире, и генная терапия является серьезным подходом к их лечению. В онкологии легкость и универсальность CRISPR/Cas9 позволили идентифицировать новые гены-мишени  и раскрыть некоторые механизмы устойчивости к терапии [24]. До сих пор большинство исследований проводилось на опухолях у взрослых. В последние годы технология CRISPR/Cas9 применяется в лечении редких детских злокачественных новообразований, сарком мягких тканей, в отношении которых этот подход представляется многообещающим [25]. Достигнуты успехи генной терапии в лечении отдельных видов рака [26–28], появились новые подходы к поиску критически важных генов в раковом геноме [29]. Саркомы относятся к наиболее агрессивным опухолям и обычно плохо реагируют на химиотерапию. В последние годы было показано, что специфическое слияние / мутации генов или избыточная экспрессия/активация генов участвуют в патогенезе развития саркомы. РНК-направляемая нуклеаза CRISPR/Cas9 является удобной и универсальной платформой для сайт-специфического редактирования генома и эпигеном-направленной модуляции. В настоящее время обсуждаются механизмы применения редактирования генома в случае саркомы, будущие направления исследований и проблемы, с которыми сталкиваются при реализации этих подходов [30]. Подход ex vivo к редактированию очень эффективен для многих болезненных состояний, включая рак и серповидноклеточную анемию, но в идеале редактирование генома также следует применять к заболеваниям, которые требуют модификации клеток in vivo. Однако использование технологий CRISPR in vivo может быть затруднено такими проблемами, как нецелевое редактирование, неэффективная или нецелевая доставка и стимуляция контрпродуктивных иммунных реакций. Исследования, направленные на решение этих проблем, могут заложить научную основу клинических испытаний с участием ZFN, TALEN и редактирования генома на основе CRISPR с учетом известных ограничений использования CRISPR у людей [31].

Иммунологические расстройства

Хроническая гранулематозная болезнь (ХГБ) является редким наследственным заболеванием фагоцитарных клеток. Имеются сообщения о первоначальных результатах, полученных у 9 пациентов с тяжелой формой ХГБ, которые получали ex vivo аутологичную генную терапию на основе CD34 и гемопоэтических стволовых клеток. Выжившие пациенты не имели новых инфекций, связанных с ХГБ, и 6 человек смогли прекратить антибиотикопрофилактику. Первичная цель была достигнута у 6 из 9 пациентов через 12 мес. наблюдения, что позволило считать ауто-
логичную генную терапию перспективным подходом для пациентов с ХГБ [32].

Атаксия-телеангиэктазия (AT) и синдром Айкарди — Гутьерес (САГ) являются наследственными нарушениями иммунитета с преобладающим неврологическим фенотипом. Доступные методы лечения лишь частично эффективны, прогноз при их применении неблагоприятный. ИПСК получают путем перепрограммирования соматических клеток пациента, сохраняя индивидуальное генетическое наследие донора и создавая модели заболевания конкретного пациента, полезные для исследования патогенеза, эффектов лекарств и разработки методов лечения. Исследовали цитотоксичность панели иммуномодуляторов с использованием ИПСК пациентов с AT или различными формами САГ [34]. Цитотоксические эффекты двух препаратов, предложенных для лечения соответственно AT и САГ (дексаметазон и мепакрин), были оценены после 72-часового воздействия. Данные были получены также для других иммуномодулирующих препаратов (тиогуанин, меркаптопурин, талидомид и леналидомид). Была проанализирована относительная экспрессия генов, участвующих в тестируемых лекарственных путях, и предложена инновационная модель in vitro, полезная для исследования механизмов лекарственных средств, потенциально эффективных при вышеуказанных заболеваниях [34].

Заболевания органов зрения и слуха

В последнее время генная терапия рассматривается как потенциально эффективное средство лечения заболеваний дегенерации сетчатки. Система CRISPR/Cas9 и ее комбинации с плюрипотентными стволовыми клетками уже используются в качестве мощного инструмента редактирования генома в офтальмологических исследованиях с учетом ее преимуществ и проблем [35]. Очерчены клинические пути для лечения наследственных заболеваний глаз на основе CRISPR и дан обзор важных этических последствий редактирования генов [36].

Примером может служить изучение ретинопатии у недоношенных детей [37]. Длинная некодирующая РНК (lncRNA) регулирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сетчатки человека, а также неоваскуляризацию сетчатки при диабетической ретинопатии. Основываясь на сходстве патогенезов ретинопатии у недоношенных детей и диабетической ретинопатии, сделали вывод о сходной роли lncRNA в патогенезе двух видов ретинопатии и разработали модель на животных (мыши) для изучения патогенеза у детей. Установили, что различно экспрессируемые lncRNA могут регулировать патогенез ретинопатии у мышей через микроРНК и множественные сигнальные пути, и предложили потенциальные терапевтические мишени для генной терапии.

Потеря слуха является одним из наиболее распространенных сенсорных расстройств, затрагивающих примерно 1 из 500 новорожденных без лечения. Мутации генов внутреннего уха способствуют большей части генетической глухоты. С технологией CRISPR/Cas9 функции генов внутреннего уха могут быть эффективно изучены путем нарушения нормальных аллелей гена. Что касается генетической потери слуха, то CRISPR/Cas9 может восстанавливать измененные мутациями гены с помощью гомологичной репарации. Показали, что CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генома может эффективно выполняться во внутреннем ухе млекопитающих in vivo. В настоящее время обсуждаются вопросы, касающиеся применения CRISPR/Cas9 в слуховых системах, связанных с генетической потерей слуха у человека [38].

Синдром Ашера является частой причиной потери слуха и зрения у людей. Были определены три клинических подтипа, на данный момент идентифицировано 10 генов USH. Охарактеризованы несколько моделей мышей Usher, которые точно воспроизводят слуховой фенотип, связанный с синдромом Ашера, и вестибулярный фенотип, связанный с некоторыми мутациями в генах USH. За последние 10 лет появились новые методы лечения синдрома Ашера, основанные на недавнем прогрессе в передаче генов и новых инструментах редактирования генов [39]. Многообещающий успех, демонстрирующий восстановление функций слуха и равновесия, достигнут с помощью различных терапевтических стратегий на моделях животных. Однако перенос метода в клинику требует его дальнейших улучшений.

Гематологические заболевания

Гемоглобинопатии — это группа наследственных заболеваний, обусловленных генетическими нарушениями, приводящими к абберантной экспрессии гемоглобина или изменениям его структуры, что приводит к тяжелым нарушениям здоровья и смерти. Серповидноклеточная анемия и β-талассемия, наиболее распространенные формы гемоглобинопатий, обычно лечатся с помощью переливаний и фармакологических препаратов. Современная терапия гемоглобинопатий основана на трансплантации аллогенных стволовых клеток от здоровых доноров, однако она может применяться только у ограниченного числа пациентов. Новым лечебным подходом является коррекция генов с помощью нуклеазы, которая включает применение инструментов точного редактирования генома для исправления вызывающей болезнь мутации. В настоящее время представлены приложения для инженерии генома с использованием CRISPR/Cas9 и рассмотрены проблемы и перспективы применения системы CRISPR/Cas9 в качестве варианта лечения серповидноклеточной анемии [40].

Гемофилия вызывается различными мутациями в генах фактора свертывания крови, включая фактор VIII (FVIII) и фактор IX (FIX), которые кодируют ключевые белки в пути свертывания крови. Выходя за рамки культивируемых клеточных систем, исследователи сейчас вступают в эпоху прямой генной коррекции in vivo с использованием различных инструментов доставки. Уже описано текущее состояние технологии редактирования генома in vivo и ex vivo, связанной с возможной коррекцией гена гемофилии, и важные вопросы, связанные с применением технологии редактирования генов гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с гематологическими заболеваниями [41–43].

Другие наследственные заболевания

Муковисцидоз — хроническое прогрессирующее аутосомно-рецессивное заболевание, связанное с нарушением функций секреторных эпителиальных клеток и приводящее, в частности, к обструкции дыхательных путей и протоков поджелудочной железы. Установлено, что болезнь вызывается мутацией в гене CFTR, что позволило бороться с фатальным исходом заболевания. В настоящее время обсуждаются возможности использования технологий геномного редактирования применительно к лечению муковисцидоза. Установлено, что именно система CRISPR/Cas9 смогла обеспечить более простой, быстрый и доступный по цене метод редактирования, чем применение ранее открытых нуклеаз ZFN и TALLEN [44].

Успешной оказалась попытка применения генотерапии в лечении буллезного эпидермолиза, проявляющегося при повреждении гена LAMB3 образованием пузырей и эрозий кожи при любом незначительном воздействии. Ребенку с тяжелой формой заболевания успешно трансплантировали трансгенный эпидермис. Его получали, выращивая культуры клеток эпидермиса пациента и обрабатывая их ретровирусами, несущими нормальную копию LAMB3. Опыт оказался успешным, прежних симптомов не наблюдается в течение 2 лет [45]. В последние годы предприняты попытки изучения с помощью генной терапии нейродегенеративных заболеваний — болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера [46, 47].

Заключение

Следует отметить, что хотя система CRISPR/Cas9 обеспечивает удобное редактирование генома, сопровождаемое многими преимуществами, она поднимает существенные этические проблемы. В Китае уже сделаны первые шаги в клинических испытаниях технологий редактирования генома, основанных на CRISPR/Cas9. Использовали эмбрионы человека с мутантным геном, приводящим к β-талассемии. В результате эксперимента в 5–10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение болезни у взрослых людей, действительно была исправлена. Однако во всех клетках редактируемых эмбрионов возникло большое количество незапланированных и, возможно, опасных мутаций. Очевидно, что технология нуждается в значительной доработке, прежде всего в улучшении специфичности белка Cas9. Несмотря на интерес к проблеме, два главных научных журнала — Nature и Science отказались публиковать результаты китайских ученых. Возникло множество этических вопросов, которые пока так и не получили единого решения в мире по поводу того, когда же можно, а когда нельзя применять редактирование генома. Пока каждая из стран решает это по-своему. Так, в Великобритании официально разрешены первые опыты по геномному редактированию эмбрионов человека. В Китае запрещено использование преимплантационной генетической диагностики для выбора пола будущего ребенка, но такая процедура не запрещена в США. Несомненно, исследования в этом направлении будут продолжаться, а правовые нормы — разрабатываться. В России генетическим технологиям уделено особое внимание в рамках национальных проектов.

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Человек стремится покорить природу, и ключ для этого — ДНК. Но чтобы подобраться к молекуле ДНК и повлиять на нее, необходимо использовать точнейшие молекулярные инструменты — белки или РНК. В этой статье рассказывается о новейшем инструменте для внесения мутаций в геном in vivo — сиквенс-cпецифичных нуклеазах.

История изучения ДНК непроста, как и любое значительное исследование. Открыта она была еще в 1868 году Иоганном Фридрихом Мишером, который выделил некое вещество, содержащее азот и фосфор, из остатков клеток в гное [1]. После того, как Мишер обнаружил, что оно обладает кислотными свойствами, вещество назвали нуклеиновой кислотой. Однако долгое время функция ДНК была неясной: ее считали всего лишь способом запасания фосфора в организме. Данная теория считалась правильной почти до середины XX века; в качестве косвенного доказательства ученые ссылались на однообразное, по их мнению, строение молекулы ДНК (состоящей исключительно из четырех различных видов нуклеотидов: дезоксиаденозина — А, дезоксигуанозина — G, дезокситимидина — Т, дезоксицитидина — С).

Носителями генетической информации первоначально предполагались белки. Потребовались опыты нескольких групп ученых, чтобы опровергнуть эту теорию. В частности, эксперименты Освальда Эвери, Колина Мак-Леода и Маклин Мак-Карти в 1944 году [2] показали, что для трансформации бактерий — приобретения болезнетворных свойств ранее безвредной культурой — необходима именно ДНК, выделенная из мертвых болезнетворных бактерий. В 1952 году были проведены опыты Альфреда Херши и Марты Чейз [3], благодаря которым выяснили, что при заражении фагами бактерий внутрь последних впрыскивается только ДНК первых, в то время как белок остается снаружи. Новое поколение фагов, однако, полностью повторяет родительское как по белку, так и по содержащейся ДНК.

Функцию ДНК, естественно, открыли раньше, чем ее вторичную структуру, которая оставалась неизвестной вплоть до 1953 года. Соответственно, из-за этого не могли установить, как проходят такие процессы как передача наследственной информации, как белки распознают определенные последовательности в ДНК и т.п.

В 1949–1951 годах Эрвин Чаргафф сформулировал свои знаменитые правила, которые говорят о строгом соотношении количества азотистых оснований внутри каждой молекулы ДНК [4] (в частности, что количество аденина равняется количеству тимина, а количество цитозина — количеству гуанина); затем Морисом Уилкинсом и Розалиндой Франклин были получены рентгеноструктурные данные, несущие структурную информацию о ДНК. На основании этих двух фактов Френсис Крик и Джеймс Уотсон предложили структуру двойной спирали ДНК [5], которая была доказана позднее в опытах Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя [6].

Как только была открыта вторичная структура ДНК, стало легче предсказывать, а затем доказывать экспериментами механизмы различных процессов, происходящих с ДНК. Репликация (удвоение молекулы ДНК), транскрипция (перенос генетической информации с ДНК на РНК), различная регуляция экспрессии генов стали главными проблемами, интересующими молекулярных биологов.

Очевидно, что для осуществления этих процессов необходимы определенные белки, которые, в свою очередь, взаимодействуют как друг с другом, так и с ДНК. И если некоторые стадии протекают неспецифично (например, у эукариот репликация ДНК может начаться во множестве участков ДНК [7]), то, например, регуляция экспрессии генов происходит с помощью взаимодействия белков с довольно консервативными, т.е. строгими последовательностями ДНК.

Эндонуклеазы рестрикции: «Режем ДНК в нужном вам месте!»

Одними из первых открытых белков, специфически связывающих ДНК, являются эндонуклеазы рестрикции. Это ферменты, которые разрезают ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям, называемым сайтами рестрикции (рис. 1) [8].

Сам термин «рестрикция» появился благодаря исследованиям фага λ и феномена контролируемой рестрикции и модификации бактериальных вирусов клетками-хозяевами. Этот процесс был впервые обнаружен в результате работ Сальвадора Лурии [9] и Джузеппе Бертани [10] в 1950-х годах. Ученые обнаружили, что если фаг λ хорошо растет в одном штамме Escherichia coli, то в другом штамме его рост падает на несколько порядков, т.е. клетка-хозяин может снижать его биологическую активность. Оказалось, что запрет роста — «рестрикция» — вызывается ферментативным расщеплением ДНК фага. Соответственно, и фермент, отвечающий за этот процесс, назвали ферментом рестрикции.

Сами ферменты были обнаружены в лабораториях Вернера Арбера и Мэттью Мезельсона [11]; причем эндонуклеазы, которые исследовались в их работах, принадлежали, как определили позже, к I классу эндонуклеаз рестрикции. Они разрезают ДНК в случайном месте снаружи от места распознавания, причем как минимум на расстоянии 1000 нуклеотидов.

В 1970-х годах Гамильтон Смит, Томас Келли и Кент Велкокс выделили и охарактеризовали первую эндонуклеазу рестрикции II класса. Этот тип ферментов рестрикции более удобен для лабораторного использования, поскольку расщепляет ДНК внутри своего сайта распознавания, который, как правило, представляет собой палиндром из 4–8 нуклеотидов. Кроме того, эндонуклеазы этого класса не нуждаются в энергетической молекуле АТФ для активности, — только в ионах магния в качестве кофактора.

В 1990-х и ранних 2000-х годах были открыты другие представители данного семейства, которые не соответствовали всем критериям этого класса ферментов [12]. На данный момент уже открыты эндонуклеазы типов IIB, IIE, IIF, IIG, IIM, IIS, IIT… Возможно, в будущем этот список еще значительно расширится.

Существует также III класс эндонуклеаз рестрикции. Они были также открыты как компоненты прокариотической защитной системы против чужеродной ДНК. Эндонуклеазы III типа распознают две отдельных последовательности ДНК длиной 5–6 нуклеотидов и разрезают её примерно через 20–30 пар после сайта распознавания. Для их работы необходимы молекулы АТФ.

Эндонуклеазы рестрикции используют для обработки ДНК в различных лабораторных экспериментах. Обычно их применяют для вставки генов в процессах генного клонирования и экспериментах по исследованию белков.

Кроме того, эндонуклеазы могут быть использованы для выявления различий в аллелях гена [13]. Это возможно только в случае, если мутация произойдет в сайте узнавания, содержащемся внутри аллеля. Таким образом, отпадает нужда в дорогостоящем секвенировании гена; в частности, до изобретения секвенирования обработка эндонуклеазами рестрикции использовалась для картирования геномов.

Одно из новейших применений нуклеаз — внесение с помощью них различных изменений в геном клетки, таких как мутации уже имеющихся генов, вставка новых генов или вырезание исходных. Это очень перспективное направление генной инженерии с широчайшими возможностями практического применения! О нем будет рассказано в следующем разделе.

Эндонуклеазы — это эффекторы, т.е. белки действия. Если они окажутся у цели, то точно ее разрежут. Но природные белки распознают лишь небольшое число последовательностей ДНК, что накладывает огромные ограничения на использование этого уникального инструмента. Ах, если бы можно было доставить эндонуклеазу к любой желаемой последовательности ДНК!..

Революция в области ДНК-связывающих белков: «Доставим ваш белок по любому адресу ДНК, используя TAL-эффекторы или CRISPR/Cas9-систему»

Одной из наиболее заманчивых идей для ученых является возможность напрямую точечно влиять на работу клетки. Для этого необходимо прицельно воздействовать на ДНК именно в области интересующего гена. Воздействие может быть разного характера: включение/выключение гена, внесение мутации и др. Для этого потребовалось уметь синтезировать белки, узнающие конкретную последовательность ДНК («следопыты»), к которым можно было бы пришить белки «действия».

Недавно открытые белки TAL-эффекторы и система Cas9 произвели настоящую революцию в нацеливании различных эффекторов на специфическую последовательность ДНК!

TAL-эффекторы: «Используем паразитов во благо»

TAL-эффекторы (Transcription Activator Like Effectors) — белки, синтезируемые многочисленным видами бактерий рода Xanthomonas — паразитами растений. Они были открыты в 2009 году практически одновременно несколькими группами ученых. TAL-эффекторы активируют считывание нужных паразитам генов в растениях-хозяевах (крайне специфично связываясь с хозяйской ДНК), что облегчает бактериальную колонизацию этого растения и выживание бактерий внутри него [14].

TAL-эффектор можно мысленно поделить на три части (рис. 2); наибольший интерес представляет средняя, крайне консервативная центральная область белка, состоящая из повторяющихся блоков размером 34 аминокислоты. В 2009 же году была показана простая и однозначная связь между повторами и узнаваемыми нуклеотидами. Блоки отличаются друг от друга лишь аминокислотами № 12 и № 13, которые и определяют вид нуклеотида, распознаваемый данным мономером. На каждый из четырех нуклеотидов ДНК приходится определенное сочетание этих аминокислот TAL-эффектора [15]; т.е. можно представить себе этот белок как паровозик, состоящий из одинаковых вагонов, центральное окошко которых покрашено в один из четырех цветов.

Простота «TALE-кода» открывает многочисленные возможности для биологического применения этих белков. Недавние исследования показали, что можно специально подобрать «вагоны» для искусственного «паровозика» и синтезировать ранее не существовавшие в природе белки для узнавания конкретных последовательностей ДНК в различных типах клеток — как растений, так и млекопитающих. Многие группы ученых уже используют искусственные TAL-эффекторы, узнающие новые последовательности ДНК, например, в томатах, Arabidopsis thaliana [16] и клетках человека [17].

Синтезированные TAL-эффекторы также сшивают с каталитическим доменом нуклеазы (см. раздел «Эндонуклеазы рестрикции») для создания TAL-эффекторных нуклеаз. Эти нуклеазы могут быть полезны для генной инженерии и генной терапии [18].

TAL-нуклеазы используют для создания двуцепочечных разрывов в строго определенном месте ДНК. Известно, что нарушенные таким образом гены клетка может чинить двумя путями: либо просто соединением концов (что может привести к случайным мутациям), либо заново синтезируя поврежденную цепь по комплементарной ей цепи ДНК (т.н. гомологичная рекомбинация).

Во втором случае вырезается значительный по длине участок ДНК, а вместо него по комплементарной (на краях разрыва) матрице синтезируется вставка, закрывающая брешь [19]. Если в клетку поместить ДНК специально мутированного гена, то он будет использован в качестве донорной матрицы, и в геном встроится желаемая мутация. Можно таким методом даже вырезать отдельные гены — или вставлять новые! Таким образом, благодаря разработанной технике сборки ДНК-узнающих повторов, TAL-эффекторы в составе гибридных белков предоставляют возможность направить желаемый эффектор к любой специфической последовательности ДНК — и добиться самых разных воздействий на ДНК: от регуляции транскрипции до внесений мутаций.

CRISPR/Cas9 система: «Неожиданное альтернативное применение защитного комплекса бактерий»

В нашем организме, после того, как мы переболели какой-то болезнью, остаются клетки памяти иммунной системы, которые при повторном попадании в организм вредителей активизируются и помогают ускоренно справиться с ними.

Бактерии справляются со своими патогенами с помощью аналогичной «системы памяти»: CRISPR/Cas-системы обеспечивают иммунитет бактерий и архей против вирусов и плазмид. Этот защитный комплекс состоит из:

1. «блокнотика памяти» — кассеты CRISPR, куда скопированы кусочки уникальных последовательностей ДНК поверженных вредителей, разделенные идентичными повторами;
2. двух РНК, которые находят жертву — последовательность ДНК повторно вторгшегося патогена;
3. белка, приводящего к подавлению чужеродных нуклеиновых кислот.

Этот комплекс был открыт в 2012 году при совместной работе ученых из США, Швейцарии, Австрии и Швеции [20], [21].

Иммунитет, обусловленный CRISPR/Cas, возникает за три стадии (рис. 3). В первой фазе бактерии или археи, у которых в геноме есть «блокнотик для записи» — CRISPR-кассета, — отвечают на появление вируса включением в конец кассеты коротких фрагментов чужеродной ДНК. На следующей стадии происходит транскрипция — считывание этой свежевключенной последовательности (образование описанных выше двух РНК) и обработка их нуклеазами. Теперь эти РНК могут специфично связаться с вирусной ДНК, и это взаимодействие через цепь событий приводит к ее расщеплению и «смерти» вредителя.

Грубо говоря, ситуация напоминает сказку про репку: первая РНК связывается с «репкой» — чужеродной ДНК — и «зовёт» вторую, вторая — специальный белок Cas9, который уже осуществляет двухцепочечный разрыв цепи чужой ДНК [22].

Несмотря на то, что в природе две РНК системы Cas9 разделены, учёные показали, что химерная РНК, представляющая собой сшитые в одну цепь вышеуказанные РНК, так же способна направлять Cas9 к ДНК-мишени. Более того, при соблюдении ряда условий можно менять последовательность первой внутри химерной РНК так, чтобы нацеливать Cas9 на желаемые гены.

Эта система даже проще TAL-эффекторов, поскольку для распознавания одного дезоксирибонуклеотида ДНК не нужен громоздкий «вагон» белка: один рибонуклеотид РНК легко и точно узнаёт комплементарный ему дезоксирибонуклеотид ДНК мишени! Экономия как в размере инструмента, так и в легкости его синтеза.

К настоящему времени показано, что эта система работает не только в археях и бактериях, но и в организмах рыб (Danio rerio), а также в клетках млекопитающих [23]. Уже установлено, что, как и в случае TAL-эффекторных нуклеаз, обработка ДНК Cas9-системой приводит к эффективному (10–30% случаев) возникновению мутаций.

* * *

Человек стремится покорить природу, и ключ для этого — ДНК. Но чтобы подобраться к ДНК и повлиять на нее, необходимо спуститься на молекулярный уровень и использовать белки или РНК. Сейчас развитие данных направлений идет стремительно, каждый месяц случаются значительные прорывы в этой области. Кто знает, какие чудеса ожидают нас через год? Возможно, будет найдена новая система, максимально упрощающая исходно сложный и кропотливый процесс вмешательства человека в работу природы.

1. Ralf Dahm. (2005). Friedrich Miescher and the discovery of DNA. Developmental Biology. 278, 274-288;
2. O. T. Avery. (1944). STUDIES ON THE CHEMICAL NATURE OF THE SUBSTANCE INDUCING TRANSFORMATION OF PNEUMOCOCCAL TYPES: INDUCTION OF TRANSFORMATION BY A DESOXYRIBONUCLEIC ACID FRACTION ISOLATED FROM PNEUMOCOCCUS TYPE III. Journal of Experimental Medicine. 79, 137-158;
3. A. D. Hershey. (1952). INDEPENDENT FUNCTIONS OF VIRAL PROTEIN AND NUCLEIC ACID IN GROWTH OF BACTERIOPHAGE. The Journal of General Physiology. 36, 39-56;
4. ERWIN CHARGAFF, STEPHEN ZAMENHOF, CHARLOTTE GREEN. (1950). Human Desoxypentose Nucleic Acid: Composition of Human Desoxypentose Nucleic Acid. Nature. 165, 756-757;
5. J. D. WATSON, F. H. C. CRICK. (1974). Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature. 248, 765-765;
6. M. Meselson, F. W. Stahl. (1958). The replication of DNA in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences. 44, 671-682;
7. Heinz-Peter Nasheuer, Richard Smith, Christina Bauerschmidt, Frank Grosse, Klaus Weisshart. (2002). Initiation of eukaryotic DNA replication: Regulation and mechanisms. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 41-94;
8. Richard J. Roberts, Kenneth Murray. (1976). Restriction Endonuclease. CRC Critical Reviews in Biochemistry. 4, 123-164;
9. Luria S.E. and Human M.L. (1952). A nonhereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J. Bacteriol. 64, 557–569;
10. Bertani G. and Weigle J.J. (1953). Host controlled variation in bacterial viruses. J. Bacteriol. 65, 113–121;
11. Seymour Lederberg, Matthew Meselson. (1964). Degradation of non-replicating bacteriophage DNA in non-accepting cells. Journal of Molecular Biology. 8, 623-628;
12. A. Pingoud. (2001). Structure and function of type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Research. 29, 3705-3727;
13. R. Zhang, Z. Zhu, H. Zhu, T. Nguyen, F. Yao, et. al.. (2005). SNP Cutter: a comprehensive tool for SNP PCR-RFLP assay design. Nucleic Acids Research. 33, W489-W492;
14. Jens Boch, Ulla Bonas. (2010). XanthomonasAvrBs3 Family-Type III Effectors: Discovery and Function. Annu. Rev. Phytopathol.. 48, 419-436;
15. M. J. Moscou, A. J. Bogdanove. (2009). A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science. 326, 1501-1501;
16. R. Morbitzer, P. Romer, J. Boch, T. Lahaye. (2010). Regulation of selected genome loci using de novo-engineered transcription activator-like effector (TALE)-type transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 21617-21622;
17. Jeffrey C Miller, Siyuan Tan, Guijuan Qiao, Kyle A Barlow, Jianbin Wang, et. al.. (2011). A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29, 143-148;
18. De Francesco L. (2011). Move over ZFNs. Nat Biotechnol. 29, 681-684;
19. Alberts B. et al. Chapter 5: DNA Replication, Repair, and Recombination. In: Molecular Biology of the Cell (4th Edition). New York: Garland Science, 2002. 845 p.;
20. M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentier. (2012). A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337, 816-821;
21. Элементы: «Прокариотическая система иммунитета поможет редактировать геном»;
22. Woong Y Hwang, Yanfang Fu, Deepak Reyon, Morgan L Maeder, Shengdar Q Tsai, et. al.. (2013). Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31, 227-229;
23. Seung Woo Cho, Sojung Kim, Jong Min Kim, Jin-Soo Kim. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 31, 230-232.